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主要通过荧光探针检测原理工作，利用DCFH-DA等探针与细胞内活性氧（ROS）反应生成荧光物质，通过荧光强度定量ROS水平‌。以下是具体原理和操作步骤：

检测原理

‌荧光探针法‌：DCFH-DA探针无荧光，可穿透细胞膜，在细胞内被酯酶转化为DCFH。DCFH被ROS氧化后生成强荧光的DCF，荧光强度与ROS浓度成正比。 ‌

‌其他方法‌：还包括化学发光法、电子顺磁共振（EPR）等，但荧光法因灵敏度高、操作简便应用。 ‌

操作步骤

‌细胞准备‌

贴壁细胞：检测前1天铺板，密度<5×10⁵/mL。

悬浮细胞：收集后调整密度至1.0×10⁶-2.0×10⁷。 ‌

‌药物诱导（可选）‌

用无血清培养基稀释药物处理细胞，孵育时间因药物和细胞类型而异（如HeLa细胞需30-60分钟）。 ‌

‌阳性对照（可选）‌

用Rosup（100 μM）处理细胞，提高ROS水平，验证检测效果。 ‌

‌探针装载‌

DCFH-DA稀释至10 μM，避光孵育30分钟。

洗涤去除未进入细胞的探针。 ‌

‌检测方法‌

‌荧光显微镜‌：FITC滤光片观察荧光，悬浮细胞需滴加至载玻片。 ‌

‌流式细胞仪‌：488 nm激发，530 nm发射，分选ROS阴性/阳性细胞。 ‌

注意事项

避光操作：DCFH-DA对光敏感，需全程避光。

细胞状态：确保检测时细胞活性良好，避免非特异性荧光干扰